t載體怎麼用

用限制性內切酶製備T載體 陸哲明，柯 楊△[北京大學臨牀腫瘤學院（北京市腫瘤防治研究所）遺傳室，北京 100034] [關鍵詞]T載體；DNA限制酶類；遺傳載體；基因擴增[摘 要] 目的：介紹一種製備T載體的方法。

方法：用限制性內切酶XcmⅠ酶切，在兩端產生T末端，製備的T載體可直接用來克隆用TaqDNA聚合酶產生帶A末端的PCR產物。結果：PCR產物直接和T載體連接，用常規氯化鈣法制備的感受態菌轉化，對轉化子提取質體進行酶切鑑定，證明陽性率達80%。

結論：製備T載體過程簡單，質量穩定，產量高，並可擴增等優點。[中圖分類號]Q342 [文獻標識碼]A [文章編號]1671 167X(2002)06 0726 03 PCR是目前體外DNA擴增最常用的方法，對PCR產物進行快速有效的克隆是開展下游許多實驗所要求的。

目前TA克隆是一種快速的，一步到位地把PCR產物直接插入到質體載體的方法。而商品化的TA克隆系統由於售價高，質量批次間不穩定且無法進行循環使用等缺點，在實際應用中，限制了T載體的廣泛使用。

本文介紹了一種簡單、高效，可在普通實驗室中製備並可反覆擴增的T載體制備方法，並經PCR產物克隆，酶切鑑定，得到了非常理想的結果。1 材料與方法1.1 製備SuperpGEM Teasy載體（簡稱pSP Teasy載體）1.1.1 製備pSP Teasy環化載體 以線性化的pGEM Teasy載體（Promega為模板，兩邊設計引物：F: HindⅢ XcmⅠG AATTCGCG R: HindⅢ XcmⅠC CGCGGCCGCCA 引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位點，3′端與模板互補，在PfuDNA聚合酶的作用下擴增，擴增產物經HindⅢ酶切後，自身環化，挑選能被HindⅢ酶切的克隆即為陽性克隆，經測序進一步證實。

1.1.2 製備pSP Teasy線性化載體 按照標準酶切體系，用XcmⅠ（NEB）酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後，玻璃奶回收，測量吸光度值（D260），調整質量濃度至50mg·L-1，此載體可直接用於克隆。3 討論PCR技術是目前體外擴增DNA最常用的方法。

有時需得到克隆化的DNA以便於雜交分析、高質量測序及從複雜PCR產物中分離目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。

定向克隆需在引物5′端引入限制性內切酶位點，PCR產物經適當內切酶酶切後產生粘端，連接到相應載體。非定向克隆有兩種策略，一種是平末端克隆，在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR產物末端，但連接效率僅為粘端連接的1/50，且自身環化率高[1]；另一種是TA克隆。

TA克隆是一種快速的，一步到位的非定向克隆法，可以把PCR產物直接插入到質體載體。TA克隆系統利用TaqDNA聚合酶的末端轉移酶活性，在擴增DNA3′末端非模板依賴地加上一個核苷酸，通常為腺苷酸[2]。

這個3′A突出端被用於把PCR產物插入到插入位點有一個3′T突出端的載體。製備好的載體，其關鍵部分是帶有3′T突出端的線性分子。

目前製備3′T載體的方法是先用平末端限制性內切酶（如EcoRⅤ）酶切載體，再用TaqDNA聚合酶在僅有dTTP的情況下，72~75℃反應，在3′末端添加一個T[1,3]。但是，實際反應過程中，由於3′末端加T為非優先聚合核苷酸，僅部分的3′端可添加T，或者有少量可能添加一個以上T，造成載體在克隆過程中自身環化高，必然增加篩選陽性克隆的難度。

另外，每次生產T載體產量有限（一般為1μg），不適於大規模生產，造成批次間質量差異大。即使商品化TA克隆試劑盒也存在陽性率低和質量不穩定的缺點。

因其價格昂貴，並且無法進行循環使用，在普及上存在一定困難。利用限制性內切酶製備T載體利用限制性內切酶特異性強，一次酶切產量高，質量穩定，易於操作等特點。

在內切酶家族中，有一類稱可變酶，它們的識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的，如本文采用的XcmⅠ，它識別序列見圖3a，在構建pSP Teasy載體時，利用其中間序列可變，在靠近T7啟動子端，設計了XcmⅠ的識別序列見圖3b，而在靠近SP6啟動子端XcmⅠ的識別序列見圖3c，這樣在XcmⅠ酶切後，其剩餘的序列如圖1，在3′端分別產生T。經查NewEnglandBiolabs公司的目錄，符合上述特徵的酶列於表1。

我們在兩個XcmⅠ之間引入HindⅢ位點有下列優點：（1）在構建pSP Teasy時提供方便；（2）經HindⅢ酶切後，可以防止載體中的XcmⅠ位點不完全酶切造成的自身環化；（3）兩個XcmⅠ位點之間，提供保護的鹼基，便於XcmⅠ酶切。用於克隆的PCR產物在連接前需經瓊脂糖凝膠電泳，如條帶鋭利，則一般無需純化即可直接用於連接；如產物有非特異擴增或引物二聚體濃度較高，最好先用低熔點膠或玻璃奶法純化。

如果擴增用具有保真功能的聚合酶，如PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶或TliDNA聚合酶，由於它們有3′~5′的外切酶活性，則PCR產物為平末端，需經純化後用TaqDNA聚合酶在dATP存在下72℃加腺苷酸尾15~30min，即可達到相同效果。插入片段（PCR產物）與載體摩爾比一般要求在3∶1~1∶3之間，但按筆者經驗，摩爾比不經優化亦可產生較好克隆效果，可能與pSP 。

T載體又稱T-vector。聚合酶鏈反應產物的克隆運載體，線性化後兩側3′端各多出一個去氧胸苷酸（T）。由於PCR產物兩側3′端通常含單個去氧腺苷酸（A），與T載體之間的A-T互補性可提高PCR產物克隆的效率。

T載體是一種克隆載體，也就是用於在受體細胞中進行目的基因擴增的載體，它不能大量表達。多用於克隆PCR產物，一般用一些常見的載體改造成的，一般的DNA聚合酶沒有3'-5'核酸外切酶活性，即酶的校正活性，在PCR產物3'末端以非模板依靠方式加上一個腺苷酸殘基（A），這樣PCR產物的3'腺苷酸可和T-載體的3'胸腺嘧啶 互補，T-載體系統進行有效連接的基礎正是這種鹼基配對作用。相反，有校正活性的聚合酶將移去這個3' 突出端，產生平端PCR產物，這種產物不能直接用T-載體系統進行克隆。

假如想要一PCR擴增基因的產物大量表達，常見的方法是先將PCR產物連入T載體擴增（所用T載體需事先設計好酶切位點），再用相應酶切下目的片段，然後連入以同樣酶切處理後的表達載體大量表達蛋白質。